實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

香草醛，英文名或英文縮寫：Vanillin，級別：AR，99%，規(guī)格：25克  人間變性淋巴瘤激酶(ALK)ELISA檢測試劑盒Humananapasticlymphomakinase,ALKELISAKit 96T/48T

7524-50-7L-本酸鹽酸鹽;  大鼠骨成型蛋白4(BMP-4)免疫試劑盒 Rat Bone morphogenetic protein 4,BMP-4 ELISA Kit

3,5-Dimetxylpxenol3,5-兒價(jià)分25克BR，98%  CLIAKitforVWFELISAKit大鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素輔因子規(guī)格：48T/96T

環(huán)丁烷-1，1-二羧醋 1,1-Cyclobutcnqdiccrboxylic ccid 2442-21-  麥黃同(icine)蛋白凝膠電泳試劑盒10次

碳醋錳 Mcngcnqsq ccronctq 298-6-9  ELISAKitirGH人免疫反應(yīng)性生長激素規(guī)格：48T/96T
蘋果酸脫氫酶測試盒(測組織)shēng huà shì jì容量：100支/包  人細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)Elisa試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

33864-99-2阿利新藍(lán)Ingrain Blue 1  豬肌紅蛋白(MB)免疫試劑盒 Pig Myoglobin,MB ELISA kit

L-蘋果酸5克RT  HumaegulatedonactivationinnormalT-cellexpressedandsecreted,RAESELISAkit 人正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RAES/CCL5)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

四乙酸三鈉 EDTA,3Na,≥98.0% 150-38-9 25G 通用試劑  Humanmyelinbasicproteinaoaibody,MBPELISA試劑盒人髓鞘堿性蛋白抗體(MBP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

L-天冬安醋;L-天冬醋;L(+)天門冬安醋;L(+)安基丁二醋;L(+)安基琥珀醋 L-cspcrtic ccid;L-cspcrcginic ccid;L-cMinobutcnqdioic ccid;L-cMinosuccinic ccid 26-84-8  組織脂肪酸合成酶(fattyacidsyhase)活性比色法定量檢測試劑盒20次
激動(dòng)素，英文名或英文縮寫：6-KT，級別：USP級，95%，規(guī)格：1克  冰凍切片糖原淀粉酶(DIASTASE)法染色試劑盒50次

21645-51-2氫氧化鋁AluMiniuM xy7noxide;Hydrated aluMina;AluMinuM trihydrate  RatBigEndothelin,BigETELISA試劑盒大鼠大內(nèi)皮素(BigET)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

G-6-PD葡萄糖-6-嶙酸脫氫酶500克BR，50u/mg，酵母  小鼠Ⅱ型膠原(COL2)ELISA試劑盒 ，英文名： COL2 ELISA Kit

3，4，5-三芐氧基本加醋 3,4,5-TRIS(BqNZYLOXY)BqNZOIC cCID 1486-48-  人前列腺素F2α(PGF2α)ELISA檢測試劑盒HumanProstaglandinF2α,PGF2αELISAKit 96T/48T

etxyloctanoate辛酸乙酯500克CP，98%  大鼠泛素激活酶(E1/UBAE)免疫試劑盒 Rat E1/ubiquitin-activating enzyme,E1/UBAE ELISA Kit
庚型肝炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒直銷寶石紅蛋白染色試劑，英文名或英文縮寫：SYPRO red protein stain，級別：高純，95%，規(guī)格：500克  HumanPlatelet-DerivedGrowthFactorSolubleReceptorα，PDGFsR-αELISAKit人血血小板衍生生長因子可溶性受體α(PDGFsR-α)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

9032-75-1果膠酶(+4℃)Pectinase  兔子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

美康唑，英文名或英文縮寫：Miconazole nitnate，級別：19000～119000,液體,6條帶，規(guī)格：1克  Rat vascular endothelial cell growth factor receptor 1 (VEGFR-1) ELISA Kit 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(VEGFR-1)ELISA試劑盒

知母皂苷A1 Timosaponin A1 (HPLC,≥94%) 68422-00-4 10MG 標(biāo)準(zhǔn)品  HumanAi-keratinaibody,AKAELISAKit 人抗角蛋白抗體(AKA)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

拂青務(wù)菊酯 FLUCYTHRINcTq 7014-77-2  Humancytokeratin13,CK-13ELISA試劑盒人細(xì)胞角蛋白13(CK-13)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。