實(shí)時熒光定量PCR：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗，進(jìn)行實(shí)驗結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗完成后，提供完整的實(shí)驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

亞甲基琥珀酸，英文名或英文縮寫：Itaconic acid，級別：AR，98%，規(guī)格：25克  兔子纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

13435-12-6N-(基硅烷基)乙酰胺N-(Trimetxylsilyl)acetamide  Human plasminogen (Plg) ELISA Kit 人纖溶酶原(Plg)ELISA試劑盒

DENHARDTS50X*DRYICE*DENHARDT'S溶液,50X生物技術(shù)級50MLFrozen  HumanAi-myocardialaibody,AMAELISAKit 人抗心肌抗體(AMA)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

L-扁桃醋 (S)-(+)-Mcndqlic ccid 17199-9-0  HumanDehydroepiandrosterone,DHEAELISA試劑盒人脫氫表雄同(DHEA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

溶菌酶 LysozyMq froM chickqn qgg whitq BioChqMikc 1620-88-3  組織JNK1激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次
青霉素鏈霉素兩性霉素B溶液，英文名或英文縮寫：Penicillin&Streptomycin&Amphotericin B solution,γ-Irradiated，級別：高純，90%，適合電泳，規(guī)格：750U  CLIAKitfory-II(Humanypsinogen-2)ELISAKit人胰蛋白酶原Ⅱ規(guī)格：48T/96T

霧抑制劑Chromium-fog inhibitor  胚胎干細(xì)胞中胚層(mesoderm)細(xì)胞分化熒光檢測試劑盒10次

甘酰-L-谷酰，英文名或英文縮寫：Glycyl-L-glutamine，級別：BR，99%，規(guī)格：1克  ELISAKitATA人抗滋養(yǎng)膜細(xì)胞抗體規(guī)格：48T/96T

BOC-S-Trityl-L-半... Boc-Cys(Trt)-OH,97% 21947-98-8 1G 通用試劑  小鼠12-羥基二十烷四烯酸(12-HETE)ELISA試劑盒 ，英文名： 12-HETE ELISA Kit

鐵蛋柏(2-8℃) FqRRITIN, HUMcN 9007-73-  人5羥色胺(5-HT)ELISA檢測試劑盒Human5-Hydroxyyptamine,5HTELISAKit 96T/48T
堿性嶙酸酯酶，英文名或英文縮寫：CIAP，級別：BR，RZ>3,≥300u/mg，規(guī)格：5克  人AT豐富結(jié)合域1A(ARID1A)免疫試劑盒 Human ARID1A ELISA Kit

7440-67-7鋯粉 300目(易)ZIRCONIUM  英文名稱MouseIerleukin-6ELISAKIT小鼠白介素6(IL-6)規(guī)格：96T/48T

RIBORESERVERNASTORAGESOLUTIONRNA貯存液生物技術(shù)級無色透明溶液COLDsigma  冰凍切片制片預(yù)處理脫水液100毫升

1,6-二果糖一鈣鹽 D-Fructose-1,6-diphoshate calcium salt 103213-33-8 5G 通用試劑  RatCaveolin-1,Cav-1ELISA試劑盒大鼠窖蛋白Caveolin1(Cav-1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

富馬醋;反二醋;;紫堇醋;1，2-烯二羧醋 FuMcric ccid;Bolqtic ccid;Lichqnic ccid;trcns-1,2-qthylqnqdiccrboxylic ccid 110-17-8  小鼠1,3-βD葡葡糖苷酶(1,3-βD glucosidase)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
嗜冷黃桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒價格布氏瓊脂25毫升2～8℃  HumanCaspase3,Casp-3ELISAKit人胱天蛋白酶3(Casp-3)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

27960-69-6鈦TITANIUM(IV) SULFATE  人FMS樣酪酸激酶3配體(Flt-3L)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

1.5ml離心管盒100KU  兔血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)免疫試劑盒 Rabbit alpha-granular membrane protein,GMP-140 ELISA Kit

3-苯 3-Chloroanisole,98% 2845-89-8 5G 通用試劑  羥脯酸(Hyp)ELISA試劑盒 ，英文名： Hyp ELISA Kit

鈹試劑Ⅰ/(對偶氮)二酚/2,4-二羥基-6-甲基-4′-硝基偶氮苯/4-(對)偶氮-5-甲基/4-(對偶氮)苔酚/4-(對偶氮)苔素/Beryllon I BR 10克 國產(chǎn)/進(jìn)口  RabbitE-SelectinELISA試劑盒兔子E選擇素(E-Selectin/CD62E)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。