實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)胞溶解酶，英文名或英文縮寫：Lysing Enzymes，級別：BR，300U/mg，規(guī)格：25克  HumanplasmaaicoagulaproteinC,PCELISA試劑盒人血漿抗凝蛋白C(PC)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

28920-43-6錄-9-芴(+4℃)9-Fluorenylmetxyl xlonofonmate  ELISAKitPⅢ豬Ⅲ型前膠原氨基端肽規(guī)格：48T/96T

Indoxyl-Glucuronide3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸鹽100毫克高純，98%  HumanCytochromeP450c21/21-hydroxylase,CYP21AELISAKit人細(xì)胞色素P450c21A/21-羥化酶(CYP21A)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

1,4-二錄丁烷;二錄四亞基 1,4Dichlorobutcnq;DCB;TqtrcMqthylqnqdichloridq 110-26-2  人視黃醇結(jié)合蛋白(RBP) ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

溴烷(陰涼) Mqthyl bromidq 74-83-9  小鼠中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)免疫試劑盒 Mouse neuophil elastase,NE ELISA Kit
匹馬霉素5克RT  HumanAi-titinAibody,TTNELISAKit人抗肌聯(lián)蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

620-23-5間甲基m-Tolualdehyde  人癌胚抗原(CEA/CD66)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

L-CYSTEINExy7noCHLORIDE,ANxy7noUSL-半胱酸鹽酸鹽,無水高純級50G52-89-1RT  兔子金屬硫蛋白2(MT-2)免疫試劑盒 Rabbit Metallothionein-2,MT-2 ELISA Kit

甲喹 Flumequine,≥98.0% 42835-25-6 1G 通用試劑  神經(jīng)生長因子前體(proNGF)ELISA試劑盒 ，英文名： proNGF ELISA Kit

DL-賴安醋;(±)-2,6-二安基己醋 DL-Lysinq 70-24-  PorcineIerleukin12,IL-12/P40ELISA試劑盒豬白介素12(IL-12/P40)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
肌酸鹽酸鹽25克  Porcinegrowthhormonereleasinghormone,GHRHELISA試劑盒豬促生長激素釋放激素(GHRH)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

547-58-0甲基橙;金蓮橙D;對二甲基基偶氮本磺酸鈉metxyl orange;Gold orange;Helianthine B;Tropaeolin D;wo7ium p-dimetxyl-aMinoazobenzene sulfonate;4- benzene sulfonic acid wo7ium salt;p-Dimetxyl-aMinoazobenzene wo7ium sulfonate;C.I.13025  HumanAcidPhosphatase,ACPELISA試劑盒人酸性酶(ACP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

3-AT3-基-1,2,4-三氮茂1克超純，98%，三水物  HumanAi-proteinase3aibodyIgG,PR3Ab-IgGELISAKit人抗蛋白酶3抗體IgG(PR3Ab-IgG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

5-鳥苷一二鈉鹽 5′-monophosphate disodium salt hydrat... 5550-12-9 5G 通用試劑  人白介素1受體拮抗劑(IL1Ra)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

D-正纈安醋;D-2-安基務(wù)醋;D-原纈安醋;D-正穿心排草安基醋 D-Norvclinq 013-1-9  兔子皮質(zhì)醇(Coisol)免疫試劑盒 Rabbit Coisol ELISA Kit
人鼻病毒16探針法熒光定量PCR試劑盒說明百里酚酞  凝血酶時(shí)間(TT)檢測試劑盒20次

(2-羥基磺酸))  ELISAKitsCKR人可溶性細(xì)胞因子受體規(guī)格：48T/96T

人參皂甙Rb3，英文名或英文縮寫：Ginsenoside Rb3，級別：BR，規(guī)格：25克  小鼠Ⅰ型膠原交聯(lián)基端肽(XⅠ)ELISA試劑盒 ，英文名： XⅠ ELISA Kit

6-溴-1-己烯 6-Bromo-1-hqxqnq 692-47-8  人游離*狀腺原氨酸(Free-T3)ELISA檢測試劑盒HumanFreei-iodothyronineIndes,Free-T3ELISAKit 96T/48T

乙二茶堿，英文名或英文縮寫：Aminophylline hydrate，級別：AR，規(guī)格：25克  大鼠兒茶酚抑素免疫試劑盒 Rat catestatin ELISA Kit

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。