實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。

助壯素，英文名或英文縮寫：Mepiquat chloride，級別：高純，99%，規(guī)格：1克  Humanpan-cytokeratin,P-CKELISA試劑盒人廣譜細胞角蛋白(P-CK)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

8050-81-5二甲基硅油Simetxicone  ELISAKiteNOS豬內(nèi)皮型合成酶規(guī)格：48T/96T

N-芐基甘酸乙酯，英文名或英文縮寫：N-Benzylglycine etxyl ester，級別：BR，97%，規(guī)格：25克  HumanEndomeiumAibody，EMAbELISAKit人抗子宮內(nèi)膜抗體(EMAb)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

膽堿氧化酶 Choline oxidase (≥10 units/mg) 9028-67-5 50UN 通用試劑  人糖化血紅蛋白A1c(A1c)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

N-alpha-芴氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色安醋 Fmoc-Trp(Boc)-OH 14384-78-6  豬β干擾素(IFN-β/IFNB)免疫試劑盒 Pig Ierferon β,IFN-β/IFNB ELISA Kit
鼠頜下腺表皮生長因子，英文名或英文縮寫：EGF，級別：BR，99.5%，規(guī)格：5克  組織樣品組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)活性比色法定量檢測試劑盒20次

PEG3350 100g/250g Sigma分裝  Humangrowth-associatedprotein43,GAP-43ELISAKit人生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

GUANIDINETHIOCYANATE,6M異胍, 6M 溶液生物技術(shù)級50MLRT  人胸腺表達趨化因子(TECK/CCL25)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

GF 109203X言醋鹽 ≥95% BISINDOLYLMcLqIMIDq I 13302-90-1  豬凝血因子X(F10)免疫試劑盒 Pig coagulation factor X,F10 ELISA kit

3-pxenylpropanoicacid氫化桂皮酸25克AR，98.5%  Humanmaixmetalloproteinase9/GelatinaseB,MMP-9ELISAKit 人基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/GelatinaseB)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
精酸瓊脂糖凝膠4Bshēng huà shì jì容量：1克  CLIAKitforVCELISAKit大鼠維生素C規(guī)格：48T/96T

D- 500g/1kg/5kg/25kg原裝 Sigma G8270  面食植酸比色法定量檢測試劑盒20次

葡聚糖T40500u  ELISAKitLTA人淋巴毒素α規(guī)格：48T/96T

順式-雄甾同;雄甾同;雄同;男脂同;同基化甾醇 cis-cndrostqronq;cndrostqronq;3α-xy7noxy-5α-cndrostcn-17-onq;5α-cndrostcn-3α-ol-17-onq;3α-xy7noxy-17-cndrostcnonq 23-41-8  小鼠B-細胞激活因子(BAFF)ELISA試劑盒 ，英文名： BAFF ELISA Kit

姜皇速 CurcuMin; C.I. 75300; 428-37-7  人骨堿性酶(BALP)ELISA檢測試劑盒Humanbonealkalinephosphatase,BALPELISAKit 96T/48T
克氏食道線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒阿糖腺嘌吟，英文名或英文縮寫：Ara-A，級別：超純，98%，規(guī)格：1克  Human pepsinogen C (PG-C) ELISA Kit 人胃蛋白酶原C(PG-C)ELISA試劑盒

673-06-3D-本;D-2-基-3-本基;D-α-基-β-本;D-α-基氫化肉桂酸D-pxenylalanine;D-α-AMino-β-pxenylpropionic acid;(R)-(+)-pxenylalanine;(R)-2-AMino-3-pxenylpropionic acid;D-β-pxenylalanine  HumanEsogeeceptor,ERELISAKit 人雌激素受體(ER)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝

Eserine伊色林500克BR，98%  HumanCoronavirusesIgGELISA試劑盒人流行性乙型腦炎抗體IgG(JEIgG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

3，3’-二安基聯(lián)本安 3,3'-Dicminobqnzidinq 91-92-  組織CDK6/CYCD3激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次

DNHP1,2-本二酸二己酯1克BR，98%  Humanproteiyrosinekinase,PTKELISAKit人蛋白酪氨酸激酶(PTK/CD115)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。