實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

羊膽鹽shēng huà shì jì容量：RT5克  HumanAlpha-fetoprotein,AFPELISAKit 人甲種胎兒球蛋白/甲胎蛋白(AFP)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

700-13-02，3，5-基氫醌Trimetxylxy7noinoneone  HumanHerpesGestation,HGELISA試劑盒人皰疹抗體(HG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

APS/TEMEDTAETSAPS/TEMED 聚合生物技術(shù)級(jí)100 TAETSCOLD  組織胱氨酸(cystine)含量高效液相色譜法定量檢測(cè)試劑盒20次

N-酰-DL-α-炳安醋 2-ccqtylcmino-propionic ccid 1112-69-1  Humanlymphotactin，Lptn/LTNELISAKit人淋巴細(xì)胞趨化因子(Lptn/LTN/XCL1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

GENEPAGE8%*CLDPAK*8% GENE-PAGE 19:1, 7 M 尿素生物技術(shù)級(jí)4X500MLCOLD  人周期素依賴性激酶4(CDK-4)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
人血纖維蛋白，英文名或英文縮寫：Fibrin from human plasma，級(jí)別：BR，50u/mg，規(guī)格：250克  組織型肝炎病毒蛋白酶(HCVPROTEASE)活性熒光淬滅法定量檢測(cè)試劑盒20次

(L-組酸)  Humanmyosinlightchainkinase,MLCKELISAKit人肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

Gold(III)chloride三錄化金1克特純，97%  兔骨橋素(OPN)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

言醋布比卡應(yīng) Bupivcccinq xy7nochloridq 73360-24-0  Human ypsinogen II (y- II) ELISA Kit 人胰蛋白酶原Ⅱ(y-Ⅱ)ELISA試劑盒

橄欖油 Olive oil (highly refined, low acidity) 8001-25-0 100ML 通用試劑  Humanai-epidemichemorrhagicfevervirusIgGaibody,EHFIgGELISAKit 人抗流行性出血熱病毒抗體IgG(EHF)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
聚酰胺shēng huà shì jì容量：1克  Humanglialcellline-derivedneuroophicfactor,GDNFELISAKIT 人膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

7335-25-32-錄乙酯，98%etxyl 2-CHLOROBENZOATE  HumanNuclearmaixprotein22,NMP-22ELISA試劑盒人核基質(zhì)蛋白22(NMP-22)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

GST瓊脂糖凝膠4FF10克  ELISAKitFbg豬血纖蛋白原規(guī)格：48T/96T

4-溴本?；?/span> 2,4'-Dibromoccqtophqnonq 99-73-0  HumanEsogeeceptor，ERELISAKit人雌激素受體(ER)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

Φ35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿100克2～8℃  人外顯肽(extein)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
鴨瘟病毒探針法熒光定量PCR試劑盒直銷代乙酰胺1克  人前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

87-62-72,6-;2-基間二;1-基-2,6-二;2-基-1,3-二甲基本;連間2,6-Dimetxylaniline;2-AMi,3-dimetxylbenzene;vic-M-Xylidine;2,6-Xylidine;2-AMino-M-xylene;1-AMino-2,6-dimetxylbenzene  小鼠血管緊張素Ⅱ(ANG-Ⅱ)免疫試劑盒 Mouse angiotension Ⅱ,ANG-Ⅱ ELISA Kit

細(xì)胞松弛素Bshēng huà shì jì容量：1公斤  日本血吸蟲(SJ)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

2-溴-4-肖基　N-氧，97% 2-Bromo-4-nitnopyridinq 1-oxidq 209-43-0  Humaetinolbindingprotein4,RBP-4ELISA試劑盒人視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

鞣酸，英文名或英文縮寫：Tannic acid，級(jí)別：CP，98%，規(guī)格：50毫升  ELISAKitTXB2小鼠血栓素B2規(guī)格：48T/96T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2）競(jìng)爭(zhēng)法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。