實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實驗，進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)。

威斯塔霉素，英文名或英文縮寫：Ribostamycin Sulfate salt，級別：BR，<62.5 μg/ml，規(guī)格：1克  兔子白介素1可溶性受體I (IL-1sR Ⅰ)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

(錄化)  Human angiopoietin receptor Tie1 (ANG-R-Tie1) ELISA Kit 人血管生成素受體Tie1(ANG-R-Tie1)ELISA試劑盒

Fmoc-D-Leu-OHN-芴甲氧羰基-D-亮酸5克特純，99%  HumanNephrinELISAKit 人蛋白(nephrin)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

溴代烷 Bromoqthcnq 74-96-4  HumanEuglobulinLysis,ELELISA試劑盒人優(yōu)球蛋白(EL)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

天狼猩紅 Sirius Rose BB (Standard Fluka, for mi... 2829-43-8 5G 染色劑  組織S腺苷同型半胱氨酸核苷酶(AdoHcynucleosidase)活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒20次
鈉培養(yǎng)基shēng huà shì jì容量：RT10克  人C肽(C-Peptide)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

1070-89-9六甲基二硅基胺基鈉wo7ium bis(trimetxylsilyl)amide  兔糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)免疫試劑盒 Rabbit Glycated hemoglobin A1c,GHbA1c ELISA Kit

磺丁基-β-環(huán)糊精shēng huà shì jì容量：25克  前列腺素H2(PGH2)ELISA試劑盒 ，英文名： PGH2 ELISA Kit

異戊醚 Isoamyl ,99% 544-01-4 25ML 通用試劑  RabbitHeatShockProtein90,HSP-90ELISA試劑盒兔熱休克蛋白90(HSP-90)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

哌拉西林鈉/哌芐青霉素鈉/氧青霉素鈉/(2S,5R,6R)-3,3-二甲基-6-(4-乙基-2,3-二氧代-1-甲?；?/span>)苯乙酰基-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)3.2.0庚烷-2-鈉鹽/Piperacillin sodium salt 生物技術(shù)級，770ug/mg， 1/5克 國產(chǎn)/進(jìn)口  Humanai-perinuclearfactor,APFELISA試劑盒人抗核周因子抗體(APF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
過嶙酸鈣shēng huà shì jì容量：500克  ELISAKitbFGF-9小鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子9規(guī)格：48T/96T

Silane 25ml 原裝 Pharmacia17133001  HumanAngiotensinⅠConveingEnzyme,ACEⅠELISAKit人血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶(ACEⅠ)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

鈦酸四異丙酯10毫克2～8℃，避光  人抗突變型瓜酸波形蛋白抗體(MCV)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

5-(4-羧基-2-肖基本氧基)間本二加醋 98% 5-(4-CcRBOXY-2-nitnOPHqNOXY)ISOPHTHcLIC cCID 143193-46-8  小鼠可溶性肌球蛋白重鏈2(sMHC-2)免疫試劑盒 Mouse soluble myosin heavy chain 2,sMHC-2 ELISA Kit

酪酸脫羧酶5克  真核細(xì)胞延伸因子2(eEF2)ELISA試劑盒 ，英文名： eEF2 ELISA Kit
海豹分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明Zinc鋅棒50毫升超純，98%  PLAUR/uPAR小鼠尿激酶型纖溶酶原激活物受體規(guī)格：48T/96T

(維生素C鈉(抗壞血酸鈉))  Humanai-Reticulinaibody,ARAELISAKit人抗網(wǎng)硬蛋白抗體(ARA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

乳糖培養(yǎng)基支RT  人淋巴毒素α(LTA)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

4-錄本同 4'-Chloroccqtophqnonq 99-91-  小鼠羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoAR)免疫試劑盒 Mouse Hydroxymethylglaryl CoA Reductase,HMG-CoAR ELISA kit

25克RT  轉(zhuǎn)錄因子抗體-1(ATF-1)ELISA試劑盒 ，英文名： ATF-1 ELISA Kit

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。