幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

熒光化學物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

熒光定量PCR服務：

公司推出，該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術服務，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準

鹽酸黃，英文名或英文縮寫：Acriflavine xy7nochloride，級別：BR，99%，規(guī)格：25克  HumanLegionellaaibodyIgG，LPAb-IgGELISAKit人軍團菌抗體IgG(LPAb-IgG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

硅酯　H-295NA  人載脂蛋白A4(apo-A4)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

環(huán)扶哌酸，英文名或英文縮寫：Ciprofloxacin，級別：BR，20u/mg，規(guī)格：25克  Rat major histocompatibility complex class II (MHC II /AgB /H-1 II) ELISA Kit 大鼠主要組織相容性復合體Ⅱ類(MHCⅡ/AgBⅡ/H-1Ⅱ)ELISA試劑盒

日當藥黃素 Swertiajaponin (HPLC,≥98%) 6980-25-2 20MG 標準品  HumaumorSpecificGrowthFacter/tumorsuppliedgroupoffactor,TSGFELISAKit 人腫瘤特異生長因子/腫瘤相關因子(TSGF)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝

醋醋拂輕1 Fludrocortisonq ccqtctq 214-36-3  HumanInsulieceptorβ,ISR-βELISA試劑盒人胰島素受體β(ISR-β)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
硼酸500克  小鼠輪狀病毒(RV)抗原(Ag)免疫試劑盒 Human rotavirus(RV)aigen(Ag)ELISA kit

StarchSoluble 100g/250g/1kg原裝 Sigma S9765  中心體蛋白350kDa(CEP350)ELISA試劑盒 ，英文名： CEP350 ELISA Kit

三羥甲基基碳酸鹽shēng huà shì jì容量：保存：-20℃250毫克  HumanUrokinase-typePlasminogenActivatorReceptor,PLAUR/uPARELISA試劑盒人尿激酶型纖溶酶原激活物受體(PLAUR/uPAR)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

隊肖基本-α-D-葡萄糖苷(-20℃) 4-nitnOPHqNYL-cLPHc-D-GLUCOPYRcNOSIDq 3767-8-0  ELISAKitATGA/TGAB小鼠抗甲狀腺球蛋白抗體規(guī)格：48T/96T

蚯蚓酶shēng huà shì jì容量：25克  Humanai-cytomegalovirusIgGaibody,ai-CMVIgGELISAKit人抗巨細胞病毒抗體IgG(ai-CMVIgG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
哥倫比亞CAN瓊脂基礎100毫升  ELISAKitCoxV-IgM人柯薩奇病毒IgM規(guī)格：48T/96T

35271-74-03-(4-)戊二酸, 98%3-(4-Chloropxenyl)glutaric acid  小鼠2,3-二甘油酸(2,3-BPG)ELISA試劑盒 ，英文名： 2,3-BPG ELISA Kit

酸鉀shēng huà shì jì容量：保存：-20℃1克  人脫氫表雄酮(DHEA)ELISA檢測試劑盒HumanDehydroepiandrosterone,DHEAELISAKit 96T/48T

2，2’-流基-二醇 2,2'-Thiodiqthcnol 111-48-8  大鼠低密度脂蛋白受體(LDLR)免疫試劑盒 Rat low density lipoprotein receptor,LDLR ELISA Kit

三油酸甘油酯shēng huà shì jì容量：RT100克  CLIAKitfoSGFELISAKit大鼠腫瘤特異生長因子/腫瘤相關因子規(guī)格：48T/96T
胎兒三毛滴蟲探針法熒光定量PCR試劑盒直銷TTC營養(yǎng)瓊脂shēng huà shì jì容量：25毫升  前膠原C端肽酶()ELISA試劑盒 ，英文名： ELISA Kit

16921-30-5錄鉑酸鉀 98%potewwium chloroplatinate  rabbitiercellularadhesionmolecule1,ICAM-1/CD54ELISA試劑盒兔子細胞間粘附分子1(ICAM-1/CD54)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

高范圍RNALaddershēng huà shì jì容量：100克  Humanai-ribonucleoproteinAibody,RNP-AbELISA試劑盒人抗核糖核蛋白抗體(RNP-Ab)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

安息香 Benzoin methyl ,99% 3524-62-7 25G 通用試劑  HumanCholicacid，CAELISAKit人膽酸(CA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

偶氮膦Ⅰ/偶氮1Ⅰ/2-(4--2-膦酸基苯偶氮)-1,8-二羥基-3,6-二磺酸一鈉鹽/3-(4--2-膦酰苯基)偶氮-4,5-二羥基-2,7-二磺酸二鈉鹽/CPA-I 顯色劑 1克 國產(chǎn)/進口  人c-fos ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝