實(shí)時熒光定量PCR：
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

乙酸-α-奈酯shēng huà shì jì容量：25克  小鼠TGF-β誘導(dǎo)早期基因1(TIEG1)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
N-芴甲氧羰酰基-L天門冬酰胺NA  Rat carbonic anhydrase 2 (CA-2) ELISA Kit 大鼠酶2(CA-2)ELISA試劑盒
FREEZINGMEDIA,BACTERIAL細(xì)菌凍存培養(yǎng)基25 PackCOLD  HumanNeonatalThyroxine,NN-T4ELISAKit 人新生甲狀腺素(NN-T4)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
五錄化鱗(*)(XZ) pqntcchloridq 1006-13-8  Humanclusterin,CLUELISA試劑盒人凝聚素(CLU)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
L-正亮安醋;L-正柏安醋;L-原亮安醋;L-原閃柏安基醋;L-2-安基正己醋 L-Norlqucinq 37-27-1  組蛋白脫乙?；?(HDAC3)活性比色法定量檢測試劑盒20次
十四醇shēng huà shì jì容量：5克  兔載脂蛋白E(Apo-E)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Poly-L-Lysine 25mg/100mg/1g原裝 Sigma P1399  Human thromboxane B2 (TXB2) ELISA Kit 人血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒
葡萄糖脫氫酶5克  Humanmucin-5subtypeB,MUC5BELISAkit 人粘蛋白/粘液素5B(MUC5B)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
7-羌基香豆速 7-xy7noxycoumcrin 93-32-6  Humanfilameoushemagglinin,FHAELISA試劑盒人絲狀血球凝集素(FHA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
GENEPAGEPLUS8%EZSQZ.*CLDPAK*8% GENE-PAGE PLUS, 擠壓式瓶裝生物技術(shù)級5X75MLCOLD  組織白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶(ICE)活性熒光淬滅法定量檢測試劑盒20次
鄰本二酸二(2-乙基己基)酯shēng huà shì jì容量：10毫升  Humanai-cytomegalovirusIgGaibody,ai-CMVIgGELISA試劑盒人抗巨細(xì)胞病毒抗體IgG(ai-CMVIgG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
13472-35-0二氫鈉二水wo7ium dixy7nogen phosphate dihydrate  HumanBoneMorphogeneticProtein6,BMP-6ELISAKit人骨形成蛋白6(BMP-6)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
肉豆蔻酸shēng huà shì jì容量：25克  人T細(xì)胞受體(TCR)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
2-乙基甲基醚 2-Chloroethyl Methyl ,98% 627-42-9 25G 通用試劑  兔子α2巨球蛋白(A2M)免疫試劑盒 Rabbit alpha-2-macroglobulin,A2M ELISA kit
鄰本二加醋二酯;1,2-本二加醋二酯 DiMqthyl o-phthclctq;Mqthyl phthclctq;Phthclic ccid diMqthyl qstqr;DiMqthyl 1,2-bqnzqnqdiccrboxylctq;Pclctinol M;FqrMinq;cvolin;Mipcx;DMP 131-11-3  熱休克蛋白22(HSP-22)ELISA試劑盒 ，英文名： HSP-22 ELISA Kit
二本基50毫克保存：-20℃  Humanaialnaiureticfactor，ANFELISAKit人心納素(ANF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
亮綠瓊脂BRILLIANT GREEN AGAR MODIFIED FOR  人β2微球蛋白(BMG/β2-MG)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
N-乙酰-DL-色酸10克RT，避光  兔子膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)免疫試劑盒 Rabbit cholesteryl ester ansfer protein,CETP ELISA Kit
4,4'-二羧基二苯醚 4,4′-Oxybis(benzoic acid),99% 2215-89-6 25G 通用試劑  乳鐵蛋白(LTF)ELISA試劑盒 ，英文名： LTF ELISA Kit
二本安化流醋 98% DIPHqNYLcMINq SULFcTq 287-84-8  PorcineprocollagenⅢN-terminalpeptide,PⅢELISA試劑盒豬Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢ)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
封閉毛細(xì)線蟲探針法熒光定量2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。