新型血小板相關(guān)內(nèi)皮分泌蛋白SCUBE1抗體的生wu素化標(biāo)記實(shí)驗(yàn)要點(diǎn):
1. 費(fèi)用 如在反應(yīng)混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在,會抑制標(biāo)記反應(yīng)。因此,蛋白質(zhì)在反應(yīng)前要對 0.1mol/L碳酸qing鈉緩沖液或0.5mol/L硼酸緩沖液充分透析;
2.所用的NHSB及待生wu素化蛋白質(zhì)之間的分子比按蛋白質(zhì)表面的ε-氨基的密度會有所不同,選擇不當(dāng)則影響標(biāo)記的效率,應(yīng)先用幾個(gè)不同的分子比來篩選最適條件;
3.用NHSB量過量也是不利的,抗原的結(jié)合位點(diǎn)可能因此被封閉,導(dǎo)致抗體失活;
4.由于抗體的氨基不易接近可能造成生wu素化不足,此時(shí)可加入去污劑如 Triton x-100, Tween20等;
5.當(dāng)游離ε-氨基(賴氨酸殘基的氨基)存在于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)時(shí),或位于酶的催化位點(diǎn)時(shí),生wu素化會降低或損傷抗體蛋白的結(jié)合力或活性;
6.生wu素還可能與不同的功能基團(tuán),如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及ben酚基,也可與糖基共價(jià)結(jié)合;
7.交聯(lián)反應(yīng)后,應(yīng)充分透析,否則,殘余的生wu素會對生wu素化抗體與親和素的結(jié)合產(chǎn)生競爭作用;
8.在細(xì)胞的熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中,中和親和素的本底低,但由于鏈霉親和素含有少量正電荷,故對某些細(xì)胞可導(dǎo)致高本底。 小鼠P物質(zhì)(mouse Substance P) 小鼠催乳素(mouse PRL) 小鼠孕酮(mouse PROG) 小鼠睪酮(mouse TESTO) 小鼠胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(mouse TARC) 小鼠組織因子(mouse TF) 小鼠組織因子抑制物(mouse TFPI) 小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1(mouse TGF-β1) 小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β2(mouse TGF-β2) 小鼠可溶性粒細(xì)胞靶受體(mouse sTREM-1) 小鼠端粒酶(mouse Telomerase) 小鼠Toll樣受體-2(mouse TLR-2) 小鼠Toll樣受體-4(mouse TLR-4) 小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(mouse TIMP-1) 小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(mouse TIMP-2) 小鼠腫瘤壞死因子-a(mouse TNF-a) 小鼠腫瘤壞死因子-b(mouse TNF-b) 小鼠腫瘤壞死因子-r(mouse TNF-r) 小鼠組織纖溶酶原激活劑(mouse t-PA) 小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白(mouse Transferrin)
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