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ELISA試劑盒的比色

比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。   其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而雙波長雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測得的吸光度即為臟物的吸光度值。zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時(shí)，是使用雙波長比色。    綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現(xiàn)問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結(jié)于下表。   操作過程中可能出現(xiàn)的問題和解決方法   問題  可能原因  解決方法  顯色淡，靈敏度偏低  1、試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長，溫度太高 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫  2、試劑盒未充分平衡  試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡 至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。 3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃ 注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以 免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意 4、保溫時(shí)間不足  校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)  5、洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長、洗滌次數(shù)增加  按說明書要求保留洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù) 6、移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，一次性使用 7、蒸餾水水質(zhì)有問題 使用新鮮合格的蒸餾水 8、底物作用時(shí)間不足  準(zhǔn)確定時(shí)  背景深，全部呈有色,  1、洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留  濃縮洗液準(zhǔn)確配制；10倍濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應(yīng) 讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋；充分洗滌，*拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染  2、樣品污染 樣品應(yīng)新鮮采集，或低溫保存，防止污染  3 、培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長 調(diào)整培養(yǎng)箱溫度，準(zhǔn)確定時(shí) 4、吸嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不* 吸嘴盡可能一次性使用 5、蒸餾水被污染 使用新鮮蒸餾水 6、酶等試劑混用  不同批號試劑勿混用  7、一次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本量過多，加樣時(shí)間太長，導(dǎo)致實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長  合理安排實(shí)驗(yàn)，避免幾塊酶標(biāo)板同時(shí)加樣  重復(fù)性不佳  1、樣品數(shù)量多少不一，加樣時(shí)間有長有短 重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與*次接近  2、保溫時(shí)間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致  重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性  3、加樣量不一致  樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴  出現(xiàn)白板，陽性對照不顯色  顯色液變質(zhì)  更換新的顯色液  洗滌液配制有誤 請按說明書所示稀釋倍數(shù)配制  未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入 注意不要漏加  終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂? 每次加液前均應(yīng)看清標(biāo)簽