DIGE熒光差異蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并*次引入了內(nèi)標(biāo)的概念，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。DIGE技術(shù)可檢測(cè)到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%以上。ELISA試劑盒 熒光染料種類雖多，但用于蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記的熒光染料不同于普通熒光染料，標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不應(yīng)該有等電點(diǎn)上的改變，分子量上的改變也應(yīng)該保持zui小而且不同熒光染料導(dǎo)致的分子量的改變應(yīng)該一致。用于蛋白質(zhì)預(yù)先標(biāo)記的熒光染料分為兩類，zui小標(biāo)記和飽和標(biāo)記。其中zui小標(biāo)記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團(tuán)-NHS脂，可以特異性的標(biāo)記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個(gè)正電荷，這樣通過取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不會(huì)發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動(dòng)到相同的位置。不過要注意，過多的染料標(biāo)記會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基被熒光標(biāo)記修飾，才可以維持被標(biāo)記的蛋白在電泳時(shí)的溶解性，因此，在標(biāo)記樣品時(shí)，保證合適的蛋白質(zhì)和染料的摩爾數(shù)比例至關(guān)重要。通過調(diào)整合適的pH值、合適的染料和蛋白質(zhì)的摩爾比，可以保證每個(gè)蛋白質(zhì)分子zui多只標(biāo)記上一個(gè)染料分子，來保證蛋白質(zhì)的分子量變化zui小。ELISA試劑盒 一、主要特點(diǎn)： 1. DIGE熒光差異分析，用于檢測(cè)蛋白表達(dá)中真實(shí)的生物學(xué)差異，并對(duì)差異進(jìn)行定量。 2. DIGE技術(shù)結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)和*的多重?zé)晒夥治黾夹g(shù)。 3. 不同的樣品分別由電荷和分子量匹配的DIGE熒光標(biāo)記物預(yù)標(biāo)記，隨后再混合并在同一塊膠上跑電泳。 4. 常規(guī)檢測(cè)到小于10%的蛋白表達(dá)差異而統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%。 二、實(shí)驗(yàn)流程： 1. 為保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，須對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)甲方提供的樣品是否合格。 2. 預(yù)實(shí)驗(yàn)順利完成后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標(biāo)記蛋白質(zhì)樣品（其中包括一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)），將標(biāo)記好的蛋白質(zhì)樣品混合，在同一塊膠上進(jìn)行雙向電泳，電泳結(jié)果分別用3種不同的激發(fā)波長(zhǎng)得到不同顏色的熒光信號(hào)，根據(jù)這些信號(hào)的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。DIGE技術(shù)可檢測(cè)到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%以上。 3. 質(zhì)譜分析（包括膠內(nèi)酶切、串聯(lián)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索） 4、蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定：質(zhì)譜的數(shù)據(jù)通過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索來確定蛋白點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因 三、主要應(yīng)用： 采用DIGE技術(shù)，通過對(duì)不同類型，不同個(gè)體的細(xì)胞、組織、或經(jīng)過不同處理和不同生長(zhǎng)條件下蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析，在研究疾病的分子機(jī)理、分子診斷、藥物作用機(jī)理、毒理學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。尤其是通過對(duì)各種疾病組織和正常組織進(jìn)行比較，可以得到針對(duì)特定疾病（例如腫瘤）的一些標(biāo)記蛋白質(zhì)，得到的這些蛋白質(zhì)可以用來作為疾病分子診斷的標(biāo)記，或?yàn)檫M(jìn)一步的疾病治療以及藥物開發(fā)提供有價(jià)值的信息。 DIGE是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確率zui高的技術(shù)之一，是已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證并且被許多的蛋白質(zhì)組學(xué)研究部門肯定的技術(shù)。DIGE技術(shù)已經(jīng)在各種樣品中得到應(yīng)用，包括人、大鼠、小鼠、真菌、細(xì)菌等，主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)，如各種腫瘤研究，尋找疾病分子標(biāo)志物，揭示藥物作用的分子機(jī)制或毒理學(xué)研究等方面。ELISA試劑盒 |
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