綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白YFP等一系列熒光蛋白為研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位提供了*的標(biāo)記物。通過(guò)構(gòu)建融合蛋白的方法使之能夠標(biāo)記過(guò)表達(dá)的目的蛋白，可以反映蛋白的亞細(xì)胞定位。在轉(zhuǎn)染中，將兩種甚至多種過(guò)表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到同一細(xì)胞中，就可以通過(guò)分析不同熒光蛋白的信號(hào)來(lái)了解不同蛋白在細(xì)胞中的共定位情況（SambrokandRusel 2001）。構(gòu)建融合蛋白的過(guò)程中，可以將熒光蛋白融合到蛋白質(zhì)的N端或者C端，因?yàn)闊晒獾鞍谆鶊F(tuán)可能會(huì)封閉蛋白質(zhì)的N端或者 C端對(duì)蛋白質(zhì)定位的影響。在研究中，推薦大家使用Clontech公司的pEGFP（綠色熒光基團(tuán)）和 dsRED（紅色熒光基團(tuán)）系列載體，它們分別提供了N端和C端兩種不同的融合方式以及3個(gè)閱讀框的選擇。其中N載體將熒光蛋白融合在C端暴露蛋白N端，而C載體將熒光蛋白融合在N端暴露蛋白C端。在構(gòu)建克隆的過(guò)程中，建議同時(shí)構(gòu)建N端和C端兩種融合方式的重組質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。 有條件的話（如果手上有GFP等熒光基團(tuán)的相應(yīng)抗體）建議先使用用Western檢測(cè)質(zhì)粒融合表達(dá)的效果。以下實(shí)驗(yàn)以使用12孔板（因?yàn)槊靠状笮≌煤线m作為被檢標(biāo)本）作為培養(yǎng)容器為例。 （一）試劑材料 1.12mm圓形蓋玻片 將蓋玻片用酸液處理過(guò)夜，自來(lái)水漂洗20次，雙蒸水漂洗20次，用鑷子取出放在干燥的絲綢上晾干，干烤滅菌，這樣可以防止玻片上出現(xiàn)痕跡，還可以防止玻片互相粘連。 2.PBS磷酸鹽緩沖液 大家可以參考分子克隆配方配制，建議配制20×儲(chǔ)存液，用前稀釋。 3.4%多聚甲醛固定液 現(xiàn)用現(xiàn)配：將4g多聚甲醛 和80ml PBS混合，再加適量氫氧化鈉（調(diào)pH用）于60-80℃水浴溶解，冷卻至室溫后用氫氧化鈉調(diào)pH至7.8，之后定容至10ml，經(jīng)濾紙過(guò)濾后于4℃保存。4%多聚甲醛固定液一定要認(rèn)真配制，否則細(xì)胞無(wú)法正常固定，形態(tài)就無(wú)法保持。 4.雙蒸水 5.DAPI（二脒基-2-苯吲哚鹽酸）溶液 用雙蒸水將DAPI配置成2mg/ml儲(chǔ)存液，于-20℃避光保存，使用時(shí)用甲醇以1∶20稀釋成使用濃度1μg/ml。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)的工作液會(huì)使染色背景臟，所以使用新近配制的工作液來(lái)進(jìn)行染色。 6.甲醇 7.無(wú)水乙醇 8.封片劑 預(yù)先配制的2% DABCO（1，4-二氮二環(huán)［2.2.2］辛烷）/PBS制備90%的甘油。在60℃下，溶解2gDABCO（抗熒光淬滅劑）于90ml甘油中，15-30min。再加入10ml1mol/LTris-HCl，pH7.5，用 5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值到8.0，冷卻到室溫，再加 10ml20% thimerosal（溶解于水），4℃于棕色瓶或箔紙包裹的瓶子中避光保存。DABCO的作用是防熒光淬滅，雖然也有有很多其他的防淬滅劑可供選擇，但是DABCO應(yīng)用得。如果需要使用其他的防熒光淬滅劑，則應(yīng)該參照相應(yīng)的說(shuō)明來(lái)使用。 9.指甲油 選購(gòu)無(wú)色的指甲油來(lái)進(jìn)行封片，因?yàn)橛械牟噬讣子椭袚饺氲臒晒馕镔|(zhì)在鏡下也能顯示熒光。也有報(bào)道說(shuō)用指甲油封片可以導(dǎo)致 GFP信號(hào)的丟失，因?yàn)橹讣子椭泻幸宜嵋阴?丙酮成分。碰到這種情況可以使用融化了的固體石蠟來(lái)代替。 （二）樣品處理步驟 1.將處理好的蓋玻片放在12孔板底部。如果細(xì)胞貼壁不牢（例如 HEK293）或者細(xì)胞半貼壁（例如PC12），可以用細(xì)胞刮子將鼠尾膠原均勻地涂抹在玻片上。也可使用1mg/ml多聚賴氨酸，但是效果不如鼠尾膠原。 2.將與培養(yǎng)基混勻后的細(xì)胞懸液加入孔中。這一步的混勻非常重要（推薦采用前后、左右“十字”形式混勻，避免渦旋），如果不勻，一般細(xì)胞都會(huì)聚集在玻片中央?yún)^(qū)域，會(huì)對(duì)形態(tài)觀察產(chǎn)生不利影響。分細(xì)胞的時(shí)候要注意：進(jìn)行形態(tài)觀察的時(shí)候應(yīng)該將細(xì)胞分得相對(duì)稀一些，密集的細(xì)胞不利于形態(tài)觀察。每孔細(xì)胞的數(shù)量根據(jù)細(xì)胞大小的不同應(yīng)該作出相應(yīng)調(diào)整，一般104細(xì)胞即可。 3.待大約24h后，細(xì)胞貼壁，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 這一步要根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染參考條件進(jìn)行，因?yàn)榧?xì)胞分得較稀，所以對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑的毒性也會(huì)更加敏感，因而有時(shí)候有必要將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒減量。初次試驗(yàn)建議轉(zhuǎn)染空載體作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率，分別設(shè)單轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染孔來(lái)方便一種蛋白影響另一種蛋白表達(dá)時(shí)的結(jié)果分析）所以一共要設(shè)以下孔：①ProteinA-pEGFP-N1；②ProteinA-pEGFP-C1；③ProteinB-dsRED-N1；④ProteinB-dsRED-C1；⑤pEGFP；⑥dsRED。 然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，來(lái)選取合適的質(zhì)粒（融合之后沒(méi)有影響蛋白的定位且表達(dá)良好）來(lái)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。 當(dāng)然，也可以和預(yù)實(shí)驗(yàn)組一起進(jìn)行。因?yàn)閷?duì)于大部分蛋白質(zhì)，N端決定了它的定位，所以使用N1載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況要多一些。設(shè)這么多組合是為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果能反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的真實(shí)亞定位和相互作用共定位。 4.轉(zhuǎn)染完成大于24h后即可在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染表達(dá)效果，當(dāng)出現(xiàn)明亮的熒光信號(hào)時(shí)就可以進(jìn)行固定。（只有明亮的綠色GFP和紅色dsRED才能被認(rèn)為是陽(yáng)性信號(hào)，淺談的顏色一般只是本底。） 5.固定用PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min。注意：如果細(xì)胞貼壁不牢（例如HEK293）或者是半貼壁細(xì)胞（例如 PC12），應(yīng)該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細(xì)胞脫片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果細(xì)胞貼壁不牢，必須使用同樣的輕柔方式），室溫固定10-15min 6.用PBS將細(xì)胞洗3遍，每遍5min。方法同前。 7.用雙蒸水將細(xì)胞洗1遍，每遍5min。方法同前。 8.DAPI染核如果需要染核，在細(xì)胞上滴加 DAPI工作液。如果細(xì)胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細(xì)胞（例如 PC12），應(yīng)該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細(xì)胞脫片。37℃濕盒中孵育15min。如果不需要染核，可直接進(jìn)行乙醇漂洗。 9.甲醇漂洗 方法同前。 10.乙醇漂洗 方法同前。 11.用針頭將在乙醇中的玻片撬起一側(cè)，用鑷子將玻片取出放在濾紙上晾干，有細(xì)胞的一面朝上。 12.封片。 取8μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下封片，封片劑會(huì)慢慢滲透分布于整個(gè)蓋薄片。（封片劑不能多加，否則玻片會(huì)滑動(dòng)，不利于在鏡下觀察。） 13.待封片劑均勻分布于蓋玻片下，即可在周圍用指甲油封?。ㄖ讣子鸵仓荒芗舆m量）。如果直接觀看而不需要保存較長(zhǎng)時(shí)間，這一步可以省略。 |
會(huì)員_a.png)