SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個新的里程碑。SMART技術(shù)是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性,只要單管,一步即可完成,不需要額外的cDNA抽提純化,或者額外的酶反應(yīng),只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA文庫,更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度,可以應(yīng)用于直接擴增基因、構(gòu)建cDNA文庫、用已知序列釣全長cDNA (RACE) ,以及用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。細胞
1、SMART法的原理
SMART技術(shù)的全稱是Switching Mechanism At 5′end of the RNA Transcrip t,其名稱反映了該技術(shù)的精髓,它充分利用了反轉(zhuǎn)錄酶Powerscrip t TM RT和限制性內(nèi)切酶Sfi I的特性(流程如圖1 ) 。該方法中全長cDNA的獲得是借助Powerscrip t TM RT的末端轉(zhuǎn)移酶活性來實現(xiàn)的。此外,實驗設(shè)計時,在cDNA*、二鏈引物的5′端引入了sfiI(A)和Sfi I(B)位點,因此只需對目的cDNA進行單酶切( Sfi I酶切) ,即可實現(xiàn)對其定向克隆。
2、SMART技術(shù)流程
與普通的建立cDNA文庫方法相比, SMART技術(shù)的不同主要包括三個方面的內(nèi)容:
(1)mRNA的制備:從總RNA 中純化mRNA 的方法是Oligo ( dT) 2纖維素柱層析法?？俁NA 通過柱時,mRNA3′端poly(A)與纖維素上連接的Oligo ( dT)鏈結(jié)合而吸附于柱上,從而被分離出來。
( 2) cDNA *鏈的合成:在合成cDNA 的反應(yīng)中事先加入的3′末端帶Oligo ( dG)的SMART引物,以O(shè)ligo ( dT) 12218為引物,mRNA模板在到達mRNA的5′末端時碰到真核mRNA*的“帽子結(jié)構(gòu)",即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個( dC) , SMART引物的Oligo ( dG)與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板,逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板,以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA 單鏈直到引物的末端。細胞
(3)通過長距離PCR (LD - PCR)擴增cDNA:以事先加入的3′末端帶Oligo ( dG)的SMART引物為5′端引物,以*鏈3′末端Oligo ( dT) 12～18引物的互補序列為3′端引物,在DNA聚合酶的催化下,互補合成cDNA的第二鏈;合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于有5′帽子結(jié)構(gòu)的mRNA 才能利用這個反應(yīng)得到能擴增的cDNA,擴增得到的cDNA就是全長cDNA,且使全長cDNA得到大量的復(fù)制和擴增,因此可消除基因組DNA和無poly(A)的RNA,并且允許用很微量的總RNA或mRNA構(gòu)建高比例全長cDNA。
